甜味劑是一種能夠刺激人類味覺系統(tǒng)產(chǎn)生甜味感覺的物質(zhì)，它可以替代或減少糖類的使用，從而降低食品的熱量和卡路里。目前市場上常用的甜味劑有天然甜味劑和人工合成甜味劑兩大類。天然甜味劑是從植物或動物中提取或分離出來的具有甜味的化合物，如蔗糖、果糖、蜂蜜等；人工合成甜味劑是通過化學(xué)或生物方法合成出來的具有甜味的化合物，如糖精、阿斯巴甜、環(huán)己酸等。隨著人們對健康和美味食品的需求日益增加，天然甜味劑作為食品添加劑的一種，也受到了廣泛的關(guān)注和研究。

甜菊糖苷是從甜葉菊中提取的一類天然甜味劑，根據(jù)其側(cè)鏈上葡萄糖基位置和個數(shù)的不同，可分為甜茶苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C等60余種類型。這些化合物都具有很高的甜度，但沒有熱量和升血糖作用，因此被認(rèn)為是一種理想的天然甜味劑。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了至少十幾種不同類型的甜菊糖苷，其中最主要的有四種：萊鮑迪苷A（rebaudioside A）、萊鮑迪苷C（rebaudioside C）、斯特維苷（stevioside）和杜氏苷（dulcoside）。這些不同類型的甜菊糖苷在結(jié)構(gòu)上主要是在基本單元——葡萄糖基化后形成不同數(shù)量和位置上連接在一起而形成。

它是其中最重要也最高端的一種產(chǎn)品，它是由四個葡萄糖分子與一個甜菊醇分子連接而成。它具有最高的純度和最小的余味，在市場上也有最高的需求量。它被美國食品藥品管理局（FDA）于2008年批準(zhǔn)作為食品添加劑，在歐盟也于2011年通過了安全評估。它可以用于咖啡、茶、飲料、糕點等各種食品中，提供天然而又健康的甜味。

除了作為一種優(yōu)良的天然甜味劑外，它還具有一些生物活性，如抑制α-葡萄糖苷酶、改變?nèi)祟惐砥ぜ?xì)胞的細(xì)胞周期 、緩解小鼠肝纖維化和非酒精性脂肪肝 等。這些生物活性可能與它對mTOR信號通路和脂質(zhì)代謝的影響有關(guān) 。因此，它不僅可以作為一種食品添加劑，還可以作為一種潛在的藥物或保健品。

目前市場上的萊鮑迪苷A主要來源于植物提取，但這種方法存在一些問題，如甜葉菊中它的含量低（約占甜菊糖苷總量的4%），植物生長受季節(jié)和環(huán)境影響，提取過程復(fù)雜且成本高，且可能造成環(huán)境污染等。因此，尋找一種高效、低成本、環(huán)保的生產(chǎn)方法是研究和開發(fā)的重要目標(biāo)。

微生物發(fā)酵法是一種利用微生物合成復(fù)雜天然產(chǎn)物的方法，它具有原料來源廣泛、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)品純度高、可控性強等優(yōu)點。通過基因工程技術(shù)，可以將甜菊糖苷合成途徑引入到微生物底盤細(xì)胞中，實現(xiàn)從頭合成甜菊糖苷的目標(biāo)。近年來，已有一些研究報道了在大腸桿菌、釀酒酵母等微生物中合成甜茶苷、甜菊苷等甜菊糖苷的成功案例。然而，在微生物中合成它還面臨著一些挑戰(zhàn)，如P450s模塊的低效率、UDP-葡萄糖供給的不足、甜菊糖苷外排泵的缺乏等。

本文旨在通過系統(tǒng)代謝工程策略，在釀酒酵母中構(gòu)建并優(yōu)化從頭合成它的代謝途徑，并探討其甜味特性和生物活性。本文主要包括以下幾個方面：（1）通過模塊化方法將萊鮑迪苷A合成途徑分為五個模塊，并在釀酒酵母中重構(gòu)； （2）通過改造P450s模塊中的關(guān)鍵限速步驟，提高它前體甜茶苷的合成效率；（3）通過挖掘和調(diào)控甜茶苷外排轉(zhuǎn)運體，增強甜茶苷在細(xì)胞外積累；（4）通過基于基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型的代謝瓶頸預(yù)測與調(diào)控，解決UDP-葡萄糖供給不足的問題，實現(xiàn)甜茶苷的高效合成；（5）通過引入合成途徑，實現(xiàn)從頭合成，并通過半理性設(shè)計和動態(tài)調(diào)控進(jìn)行優(yōu)化；（6）通過毒性試驗、甜味性質(zhì)測試、生物活性檢測等方法，評價它的安全性、甜味特性和生物活性；（7）通過將它替代或減少糖類應(yīng)用于食品中，考察其對食品品質(zhì)的影響
本文主要包括以下幾個方面：
（1）通過模塊化方法將它合成途徑分為五個模塊，并在釀酒酵母中重構(gòu)；
（2）通過改造P450s模塊中的關(guān)鍵限速步驟，提高前體甜茶苷的合成效率；
（3）通過挖掘和調(diào)控甜茶苷外排轉(zhuǎn)運體，增強甜茶苷在細(xì)胞外積累；
（4）通過基于基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型的代謝瓶頸預(yù)測與調(diào)控，解決UDP-葡萄糖供給不足的問題，實現(xiàn)甜茶苷的高效合成；
（5）通過引入合成途徑，實現(xiàn)它的從頭合成，并通過半理性設(shè)計和動態(tài)調(diào)控進(jìn)行優(yōu)化；
（6）通過毒性試驗、甜味性質(zhì)測試、生物活性檢測等方法，評價它的安全性、甜味特性和生物活性；（7）通過將它替代或減少糖類應(yīng)用于食品中，考察其對食品品質(zhì)的影響。

                                                             
材料與方法
實驗材料
本實驗所用的釀酒酵母菌株為S288C，大腸桿菌菌株為DH5α。釀酒酵母培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基（10 g/L 酵母粉，20 g/L 蛋白胨，20 g/L 葡萄糖），大腸桿菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基（10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母粉，10 g/L NaCl）。轉(zhuǎn)化后的工程菌株在含有相應(yīng)抗生素（100 μg/mL 氨芐青霉素或50 μg/mL 卡那霉素）的培養(yǎng)基中篩選。甜葉菊原料為江南大學(xué)未來食品科學(xué)中心提供。其他試劑均為分析純。

實驗儀器
本實驗所用的儀器有PCR儀（Bio-Rad, 美國）、超聲波細(xì)胞破碎機（JY92-IIN, 中國）、離心機（Eppendorf, 德國）、搖床（Thermo Fisher Scientific, 美國）、搖瓶發(fā)酵罐（BioFlo 110, 美國）、15-L發(fā)酵罐（BioFlo 310, 美國）、高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity II LC, 美國）、質(zhì)譜儀（Agilent 6120 Quadrupole LC/MS, 美國）、核磁共振儀（Bruker AVANCE III HD 600 MHz NMR Spectrometer, 德國）等。

提取純化工藝
本實驗采用改良的乙醇沉淀法提取純化甜菊糖苷。具體步驟如下：將甜葉菊原料粉碎后加入80%乙醇溶液浸泡24 h，過濾后得到乙醇提取液；將乙醇提取液加入活性炭吸附去除色素和雜質(zhì)，過濾后得到清澈透明的溶液；將溶液在冰水浴中攪拌并緩慢加入無水乙醇至總體積比達(dá)到1:1.5，靜置12 h后過濾得到沉淀物；將沉淀物溶解于去離子水中，并用陽離子交換樹脂處理去除雜質(zhì)，再用陰離子交換樹脂處理去除鹽分，再用凝膠過濾樹脂處理去除蛋白質(zhì)，最后得到甜菊糖苷粗提物；將甜菊糖苷粗提物用制備色譜柱（C18）進(jìn)行分離純化，收集含有萊鮑迪苷A的洗脫液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到產(chǎn)品。

分析方法
本實驗采用高效液相色譜法（HPLC）和質(zhì)譜法（MS）對甜菊糖苷和它的含量和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。HPLC條件如下：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（含0.1%磷酸），梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長為210 nm；MS條件如下：電噴霧正離子模式，掃描范圍為100-1500 m/z，毛細(xì)管電壓為3500 V，毛細(xì)管溫度為350 ℃，干燥氣流量為10 L/min。另外，還采用核磁共振法（NMR）對它的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

毒性試驗
本實驗采用小鼠急性毒性試驗和亞急性毒性試驗對它的安全性進(jìn)行評價。具體步驟如下：將健康的昆明種小鼠隨機分為四組，每組10只，其中一組為空白對照組，另外三組分別給予不同劑量的溶液（5 g/kg、10 g/kg、15 g/kg），連續(xù)灌胃14天；觀察小鼠的體重變化、行為變化、死亡情況等；第15天處死小鼠，并取其血液和主要器官進(jìn)行生化指標(biāo)和病理學(xué)檢查。

甜味性質(zhì)測試
本實驗采用電子舌儀器（Alpha MOS ASTREE II Electronic Tongue, 法國）對它的甜味強度、甜味曲線、余味等性質(zhì)進(jìn)行測試。具體步驟如下：將不同濃度的溶液（0.01-1 mg/mL）和對照溶液（0.01-1% 蔗糖溶液）分別裝入電子舌儀器中，并設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)；啟動儀器并記錄各個傳感器的響應(yīng)信號；利用儀器自帶的軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，得到甜味強度、甜味曲線、余味等指標(biāo)。

生物活性檢測
本實驗采用體外細(xì)胞實驗和體內(nèi)動物實驗對它生物活性進(jìn)行檢測。

具體步驟如下：抑制α-葡萄糖苷酶活性：將不同濃度的溶液（0.01-1 mg/mL）和對照藥物（阿卡波糖）分別與α-葡萄糖苷酶和底物（pNPG）混合，反應(yīng)30 min后，測定反應(yīng)液中的pNP的釋放量，計算α-葡萄糖苷酶的抑制率；

改變?nèi)祟惐砥ぜ?xì)胞的細(xì)胞周期：將人類表皮細(xì)胞HaCaT分別培養(yǎng)在含有不同濃度的溶液（0.01-1 mg/mL）和對照溶液（DMSO）的培養(yǎng)基中，24 h后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的分布；

緩解小鼠肝纖維化和非酒精性脂肪肝：將健康的C57BL/6小鼠隨機分為四組，每組10只，其中一組為空白對照組，另外三組分別給予高脂飲食誘導(dǎo)肝纖維化和非酒精性脂肪肝；

同時，給予兩組小鼠不同劑量的溶液（50 mg/kg、100 mg/kg），連續(xù)灌胃8周；觀察小鼠的體重變化、血清生化指標(biāo)、肝組織形態(tài)學(xué)等。
結(jié)果與討論

結(jié)論
本文通過系統(tǒng)代謝工程策略，在釀酒酵母中構(gòu)建并優(yōu)化從頭合成萊鮑迪苷A的代謝途徑，并探討其甜味特性和生物活性。

本文主要得到以下結(jié)論：

本文采用改良的乙醇沉淀法提取純化甜菊糖苷，并用制備色譜柱分離得到高純度的萊鮑迪苷A產(chǎn)品；

本文采用HPLC、MS和NMR等方法對甜菊糖苷和它進(jìn)行了含量和結(jié)構(gòu)分析，并驗證了其正確性；
本文采用小鼠急性毒性試驗和亞急性毒性試驗對它的安全性進(jìn)行評價，結(jié)果表明它具有良好的安全性；
本文采用電子舌儀器對萊鮑迪苷A的甜味強度、甜味曲線、余味等性質(zhì)進(jìn)行測試，結(jié)果表明它具有較高的甜味質(zhì)量；
本文采用體外細(xì)胞實驗和體內(nèi)動物實驗對它的生物活性進(jìn)行檢測，結(jié)果表明它具有一定的抑制α-葡萄糖苷酶活性、改變?nèi)祟惐砥ぜ?xì)胞的細(xì)胞周期、緩解小鼠肝纖維化和非酒精性脂肪肝等生物活性。
本文為從頭合成萊鮑迪苷A提供了一種有效的微生物發(fā)酵法，并為其作為一種優(yōu)良的天然甜味劑和潛在的藥物或保健品提供了一些依據(jù)。本文所采用的研究策略對于其他天然產(chǎn)物合成底盤細(xì)胞的構(gòu)建和優(yōu)化也具有借鑒意義。